来一水AV@lysav|亚洲欧美日韩综合网通|国产精品日日做人人爱|久久久久亚洲AV片无码

產(chǎn)品列表PRODUCTS LIST

首頁 > 技術與支持 > PCR反應的主要物質(zhì)探究
PCR反應的主要物質(zhì)探究
點擊次數(shù):87 更新時間:2024-12-09

      PCR反應的物質(zhì)主要包括模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+濃度。這些物質(zhì)在PCR反應中發(fā)揮著至關重要的作用。
1.引物

引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則:
①引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為宜。引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
2.酶及其濃度
目前有兩種Taq DNA聚合酶,一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
3.dNTP的質(zhì)量與濃度
dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris-HCL緩沖液將其pH值調(diào)節(jié)到7.0~7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。
在PCR反應中,dNTP應為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)。當其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。
4.模板(靶基因)核酸
模板核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一。傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理樣本。SDS的主要功能是:溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;
蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機溶劑酚與
CHCl3抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。
5.Mg2+濃度
Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現(xiàn)非特異擴增;濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產(chǎn)物減少。
綜上所述,PCR反應的物質(zhì)主要包括模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+。這些物質(zhì)的質(zhì)量和選擇對于PCR反應的成功與否具有重要影響。

 

欧美成人三级视频在线| 国产乱子伦精品中文| 欧美成人精品第一区二区三区| 亚洲日本中文久久一区| 国产成人精品无码一区二区| 日本在线观看| 亚洲熟妇av一区| 丰满的熟女爽死你| 亚洲国产成人综合一区二区三区| 91精品国产色综合久久久蜜臀 | 娇妻在客厅被朋友玩得呻吟动漫| 亚洲中文字幕在线19页| 久久大香伊蕉在人线观看热| 欧美一区二区三区久久久久久桃花| 亚洲日本一区二区三区四区| 狠狠色噜噜狠狠狠888米奇视频| 极品人妻洗澡后被朋友玩| 亚洲一区二区三区AV无码| 色婷婷欧美综合五月| 久久伊人国产精品网| WWXX在线观看免费| 国产免费视频| 亚洲一区精品无码色成人| 国产又爽又黄无码无遮挡在线观看 | 国产欧美激情一区二区| 国产一区二区三区成人欧美日韩在线观看| 尤物国产在线精品福利三区| 国产精品国产三级国产A| AV免费网站在线观看| 亚洲免费一区二区电影| 久久精品女人天堂AV免费观看| 欧美三级久久久久久| 中文字幕精品久久久久人妻| 中文字幕――色哟哟| 欧洲人妻丰满AV无码久久不卡| 国产精品亚洲欧美一区麻豆| 亚洲熟妇无码一区二区三区导航| 少妇特大毛BBW| 欧美 变态 另类 人妖| 精品国产乱码久久久久久水果| 亚洲一区二区在线视频中文字幕|